LncRNA LINRIS-結直腸癌的預后生物標志物
欄目:最新研究動態 發布時間:2020-03-30
結腸癌(CRC)是一種侵襲性的原發性腸惡性腫瘤,在全球所有類型的癌癥中,其發病率均排在第三位,而其死亡率則位居第二......

   結腸癌(CRC)是一種侵襲性的原發性腸惡性腫瘤,在全球所有類型的癌癥中,其發病率均排在第三位,而其死亡率則位居第二。 因此,尋找新的CRC治療策略具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在癌細胞的表觀遺傳調控中起著不可忽略的作用。小編為大家帶來最新發表于Molecular Cancer上的文章:“LncRNA LINRIS stabilizes IGF2BP2 and promotes the aerobic glycolysis in colorectal cancer”。這項研究旨在確定一種特定的lncRNA,該基因可促進結直腸癌(CRC)的進展,并可能成為潛在的治療靶標。我們在人類CRC樣本中篩選了高表達的lncRNA,并將其與匹配的鄰近正常組織進行比較。RNA下拉和RNA免疫沉淀(RIP)分析證實了與LINRIS相互作用的蛋白質。在體外和體內測試了被LINRIS抑制的CRC細胞的增殖和代謝改變。

結果:
1.LINRIS在CRC中高表達,預后差
   為了探索可能影響CRC進展的lincRNAs,我們將CRC期患者的腫瘤組織與配對的鄰近正常組織進行RNA-seq轉錄組比較。基于RNA-seq分析,我篩選出7個高表達lncRNA,包括LINC00920(更名為LINRIS)(圖1a)。我們發現LINRIS的高表達與CRC患者的不良總生存相關(圖1b,c)。根據TCGA數據庫,與正常細胞中的表達相比,大多數類型的腫瘤和CRC細胞系中LINRIS的表達上調(圖1d和圖1e),這些結果表明LINRIS通常起致癌基因的作用。食管鱗狀細胞癌(ESCC),胃癌(GC)和胰腺導管腺癌(PDAC)的患者樣本中也顯示了LINRIS在消化道癌癥中的致癌狀態(圖1f)。接下來,我們用shRNA敲除CRC細胞中的LINRIS。 使用BrdU和3D培養法比較了用LINRIS特異性shRNA(sh-1和sh-2)轉染的CRC細胞與陰性對照(sh-NC),結果確定了LINRIS的促癌作用(圖1g-i)。 通過RNA FISH分析,我們發現LINRIS主要位于細胞質中(圖1j-l)。



2.LINRIS與IGF2BP2相互作用并維持其表達
   為了確定LINRIS誘導CRC細胞進程的分子機制,我們進行了RNA下拉測定和質譜分析,以探索可能與LINRIS相關的蛋白質。我們確定IGF2BP2作為我們的第一個靶標。如圖2a-d所示,LINRIS可以直接結合到IGF2BP2。為了定位靶向IGF2BP2的LINRIS的結合位點,我們首先構建了兩個截短的LINRIS載體并進行了RNA下拉測定,因為該lncRNA的長度僅為913 bp。但是,LINRIS的N端(1–570 nt)和C端(571–913 nt)片段都不能與IGF2BP2緊密結合(圖2e)。因此,根據其二級結構,我們構建了另一個帶有LINRIS 450-640 nt片段的載體。 RNA下拉分析表明該中間區域(450-640 nt)負責LINRIS和IGF2BP2之間的結合。
   通過測量LINRIS和IGF2BP2在人CRC細胞系中的表達,我們發現它們之間呈正相關(圖2f,g)。 HCT116和DLD-1細胞中的LINRIS敲低均顯著下調了IGF2BP2的表達(圖2h)。 此外,敲除LINRIS會顯著增加IGF2BP2的泛素化,但會抑制IGF2BP2調節的mRNA(圖2i)。 因此,我們認為IGF2BP2可能是LINRIS分子機制的關鍵,并且該lncRNA可能阻止了IGF2BP2的降解。



3.LINRIS保護IGF2BP2不被自噬降解
   IGF2BP2由2個RNA識別基序(RRM)和4 K同源性(KH)域組成,我們建立了3個帶有FLAG標簽的載體,其中包含IGF2BP2的片段在非活性區彼此重疊(圖3a)。 RIP分析表明LINRIS主要結合到RRM區域(圖3b)。 然后,我們從CPLM數據庫中獲得了實驗確定的IGF2BP2泛素化位點。 如圖3c所示,與野生型(WT)相比,代替K77R的K139R泛素突變顯著損害了IGF2BP2的泛素化。 此外,該突變還消除了RNA下拉測定法中LINRIS和IGF2BP2之間的結合(圖3d),表明LINRIS通過掩蓋K139抑制了IGF2BP2的泛素化。
   為了闡明IGF2BP的降解模式,用蛋白合成抑制劑CHX處理LINRIS表達下調的CRC細胞,其IGF2BP2半衰期比未處理的對照細胞要短(圖3e)。然而,在sh-LINRIS轉染的細胞中,當用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞時,內源性IGF2BP2表達不會增加(圖3f),這表明IGF2BP2的降解可能與比泛素-蛋白酶體途徑更復雜的機制有關。
   除了泛素-蛋白酶體系統(UBS),細胞蛋白在泛素化后可從自噬-溶酶體途徑(ALP)降解(圖3g)。如圖3h所示,內吞IGF2BP2蛋白的減少被自噬抑制劑bafilomycin A1(Baf A1),NH4Cl和3-甲基腺嘌呤(3-MA)成功逆轉。相反,自噬激活劑Earle的平衡鹽溶液(EBSS)和雷帕霉素(Rap)降低了IGF2BP2的水平(圖3i)。 EBSS處理的細胞還表現出IGF2BP2和LC3B的共定位增加(圖3j)。綜上所述,提示LINRIS介導的IGF2BP2降解是通過泛素化自噬途徑實現的。



4.LINRIS與IGF2BP2相互作用影響MYC介導的糖酵解
   由于MYC的mRNA被IGF2BP2識別為其眾所周知的下游靶點,我們研究了LINRIS與IGF2BP2相互作用時糖酵解的變化。如圖4a、b所示,LINRIS被敲除后,其介導糖酵解的下游基因GLUT-1、PKM2、LDHA也表現出與MYC一致的水平下降。此外,MYC、GLUT-1、PKM2和LDHA的mRNA水平與CRC組織中的LINRIS水平呈正相關(圖4c)。如圖4d和e所示,沉默LINRIS可導致HCT116和DLD-1細胞糖酵解的減弱。圖4f顯示LINRIS基因敲除降低了一些典型的糖酵解產物。綜上所述,LINRIS對于維持癌細胞的糖酵解是必要的,糖酵解可能影響CRC的增殖。此外,我們用過表達IGF2BP2的質粒轉染了CRC細胞。 如圖4g-i所示,在HCT116和DLD-1細胞中,在某種程度上挽救了由LINRIS敲除誘導的增殖和糖酵解受損。



5.LINRIS的抑制抑制了體內CRC的生長
   為了研究低LINRIS表達是否會抑制體內CRC腫瘤的生長,我們向BALB/c裸鼠的盲腸注射了具有或不具有LINRIS敲低的HCT116細胞(sh-NC,sh-1和sh-2)。 與具有sh-1或sh-2的細胞相比,HCT116/sh-NC細胞在4周內形成了更大,更重的原位腫瘤(圖5a和b)。此外,我們用異種移植(PDX)模型測試了抗LINRIS治療的體內作用。如圖5c,d所示,通過RNAi抑制LINRIS可顯著抑制腫瘤的生長。切除的腫瘤切片的IHC染色顯示,隨著LINRIS的耗竭,與IGF2BP2和MYC一致的Ki-67表達降低(圖5e和f)。總體而言,阻塞LINRIS-IGF2BP2-MYC軸是有希望的CRC治療方法。



6.GATA3抑制LINRIS的轉錄活性
   為了研究調控LINRIS轉錄的因素,我們使用JASPAR數據庫預測了潛在的轉錄因子,并發現GATA3具有與LINRIS啟動子結合的最大可能性(圖6a)。使用Oncomine數據庫分析了來自多個實驗的CRC微陣列數據,該數據表明GATA3在CRC組織中的表達水平低于正常組織(圖6b)。此外,根據TCGA數據庫,更高的GATA3表達與CRC患者的更好預后相關(圖6c)。抑制GATA3成功地解放了LINRIS的轉錄(圖6d)。 ChIP-PCR分析顯示LINRIS啟動子區域被GATA3占據(圖6e),熒光素酶啟動子分析顯示GATA3過表達抑制LINRIS活性,反之亦然(圖6f,g)。此外,LINRIS啟動子中GATA3結合位點的突變消除了這種轉錄調控(圖6h)。通過分析中山大學癌癥中心的人類CRC樣本中LINRIS和GATA3的mRNA表達,我們還觀察到它們之間呈負相關(圖6i)。我們還通過RNA ISH分析測量了LINRIS的表達,并通過IHC分析測量了GATA3的表達(圖6j)。如圖6k所示,增加的LINRIS表達更可能伴隨著GATA3表達的降低,反之亦然。總之,GATA3抑制了LINRIS的轉錄。



7.LINRIS-IGF2BP2-MYC軸與CRC的發生發展密切相關
   為了進一步說明LINRIS-IGF2BP2-MYC軸在CRC發育中的臨床和病理學意義,我們分析LINRIS、Ki-67,IGF2BP2,MYC,GLUT-1,PKM2和LDHA的表達(圖7a)。如圖7b所示,高LINRIS組與Ki-67,IGF2BP2,MYC,GLUT-1,PKM2和LDHA的高表達相一致,而低LINRIS組表現出相反的結果。此外,與正常組織相比,這些患者的腫瘤組織中的IGF2BP2表達明顯更高(圖7c,d)。 IGF2BP2的較高表達也與CRC患者的預后不良有關(圖7e)。高LINRIS / IGF2BP2組的預后較其他兩組差(圖7f)。綜上所述,LINRIS-IGF2BP2-MYC軸深刻影響了CRC的發展和預后,并成為潛在的治療靶點。

結論:
   我們在CRC中發現了一種名為LINRIS的高表達lncRNA。LINRIS通過泛素化-自噬途徑阻斷IGF2BP2的降解。因此,MYC介導的糖酵解被下調,抑制了體內外CRC細胞的增殖。LINRIS-IGF2BP2-MYC軸促進CRC的進展。LINRIS是一種獨立的CRC預后生物標志物。

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