新發現-納米微球治療結腸炎
欄目:最新研究動態 發布時間:2020-03-31
炎癥性腸病(IBD)是一類發病機制尚不清楚的慢性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病......

   炎癥性腸病(IBD)是一類發病機制尚不清楚的慢性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。其臨床表現為腹痛、腹瀉和粘液膿血便等癥狀。近年來其發病率在我國快速增長,2015年時我國患病人數已達到35萬,近十年患者人數增長24倍。由于缺乏有效的治療藥物,IBD是不可治愈的疾病。隨著病情的發展可以引起腸道致殘性改變,包括腸穿孔、腸梗阻和腸癌等,嚴重影響病人生活質量。
   在炎癥反應過程中,腸黏膜屏障破壞,病原微生物進入固有層,激活固有免疫和獲得性免疫系統而誘發炎癥反應,這種炎癥反應又會進一步破壞腸上皮的組織結構,進而導致更多的病原菌進入固有層,加劇炎癥反應。目前,關于潰瘍性結腸炎的研究主要集中在免疫細胞過度激活的調控機制上。然而,腸道上皮在炎癥反應中的功能和作用長期被人們忽視。
   2019年2月16日,《Gastroenterology》(IF=20.773)雜志發表“MicroRNA-31 Reduces Inflammatory Signaling and Promotes Regeneration in Colon Epithelium, and Delivery of Mimics in Microspheres Reduces Colitis in Mice”文章,此報道首次發現了炎癥信號在結腸炎中可以激活腸上皮細胞的“自我修復”機制,即受炎癥信號誘導的一種短核苷酸片段microRNA—miR-31負反饋地抑制上皮細胞炎癥反應同時促進上皮再生;并建立了一種適合直腸給藥的miR-31納米-微球體藥物,非常顯著地預防和治療了結腸炎。

   此研究路線圖-促炎癥因子受體IL-17R和受體結合蛋白Gp130負反饋抑制炎癥反應,并通過激活WNT和抑制Hippo信號通路促進腸上皮再生過程。miR-31模擬物納米-微球體藥物可以顯著促進在炎癥反應中損傷上皮的修復過程。
一、MIR31在IBD發炎的黏膜中表達增加,并受STAT3和NF-kB信號通路的調節

   結腸炎(IBD)包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩疾病(CD);葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導小鼠實驗性結腸炎;炎癥性腸粘膜中MIR31表達水平與UC患者C反應蛋白,紅細胞沉降率,Mayo評分和UC內鏡嚴重程度指數以及C反應蛋白,紅細胞值呈正相關。CD患者中C反應蛋白,紅細胞沉降率,CD活性指數和CD的簡單內鏡評分值分別與MIR31表達水平呈正相關(圖1C和D)。DSS治療后發炎的結腸中MIR31的急劇上調(圖1E和F)。在經過5天的脈沖后停藥2天后,MIR31表達迅速下降,恢復到治療前的基線(圖1E)。綜上所述,MIR31主要在結腸上皮細胞中表達。在白細胞和基質細胞中也觀察到了DSS誘導的MIR31表達上調(補充圖1B)。MIR31的啟動子中鑒定了1個STAT3和2個NF-kB結合位點(補充圖1C)。

二、MIR31的丟失會加劇炎癥反應并延遲上皮再生

   MIR31缺失對結腸的影響.補充圖結果:通過同時使用MIR31種系敲除(KO)和Villin Cre驅動的結腸上皮條件性KO(cKO)小鼠(補充圖2A)。與對照組相比,MIR31 KO和cKO小鼠的結腸長度沒有明顯改變(補充圖2B)。隱窩細胞增殖,尖端細胞凋亡,或野生型(WT)和KO小鼠之間的杯狀細胞數(補充圖2C–I)在飲用水中施用DSS,可減輕WT和MIR31 KO小鼠的結腸炎。給予DSS 5天,然后恢復3天。 DSS治療4天后,MIR31 /小鼠的體重減輕比野生型小鼠明顯多,并且在治療終止時體重沒有恢復(圖2A)。與對照相比,存活率降低(圖2B),較短的結腸長度(圖2C和D),較大的脾臟(圖2C和D)和較高的臨床疾病評分(圖2E)。時程分析顯示嚴重發炎在MIR31 /小鼠中對DSS治療的運動反應和DSS去除后再生反應受損。

   DSS治療后MIR31 /小鼠中增強的免疫反應。我們發現增加DSS治療的MIR31 /小鼠中白細胞和巨噬細胞的數量(圖3A和B),促炎細胞因子和炎癥小體成分的水平增加以及炎性抑制劑IL10的水平降低(圖3C–G)。促炎NF-kB和STAT3信號通路在MIR31 /小鼠中被過度激活(圖3H和I)。綜上所述,MIR31的丟失導致免疫反應亢進進行DSS治療。

三、MIR31直接抑制Il6st(編碼GP130),Il7r,和Il17ra在結腸上皮細胞內

   RNA和DSS處理后,MIR31 /小鼠結腸中Il6st,Il7r和Il17ra的蛋白質水平顯著升高(圖4A和B)。DSS治療5天后,MIR31 /結腸中GP130 GP,IL7Rt和IL17RAt細胞的數量顯著增加(圖4C–F)。體外分析顯示,MIR31模擬物抑制了Il6st,Il7r和Il17ra的表達,而MIR31抑制劑則促進了它們的上調(圖4G),表明這些推定的靶基因受MIR31以細胞自主方式調節。 3’端UTR-熒光素酶波特試驗顯示,MIR31模擬物顯著抑制了WT Il6st,Il7r和Il17ra 3?UTR活性,但對MIR31結合位點發生突變的報告基因沒有明顯影響(圖4H和補充圖9B)。在DSS處理過程中,Il6st,Il7r和Il17ra的表達下降(圖4I和J),與MIR31水平成反比。這些MIR31靶基因的上調在cKO結腸中得到進一步證實(圖4K和L)。在人UC組織中GP130表達降低(圖4M)。總之, Il6st,Il7r和Il17ra的轉錄本是MIR31的直接靶點,并且它們的調節可能會影響MIR31在抑制腸粘膜免疫反應中的作用。

   WT小鼠的結腸上皮均激活了報告基因活性,而在MIR31中其報告活性明顯降低/結腸(圖5A和補充圖11A)。,DSS后RNA和蛋白質水平在MIR31 /小鼠結腸中均顯著降低了Ctnnb1(編碼b-catenin)和WNT靶基因Ccnd1(編碼cyclin D1)和Axin2的表達水平治療(圖5B和補充圖11B)。在5個月后MIR31 /小鼠結腸中這些Wnt拮抗劑的水平上調DSS治療的天數(圖5C和補充圖11E)。在人UC樣品中觀察到DKK1和AXIN1減少(補充圖11F)。體外測定還顯示,在用MIR31抑制劑治療時,這些假定的靶基因的表達上調(圖5D)。3’UTR-熒光素酶報告基因檢測結果表明,MIR31模擬物顯著抑制了WT Axin1,Gsk3b和Dkk1 3?UTR活性,但對MIR31結合位點發生突變的報告基因沒有明顯影響(圖5E和補充圖9B)。總之,MIR31可以通過以下途徑激活WNT信號通路。

四、基于MIR31的OKGM-PS微球遞送足以緩解DSS誘導的炎癥

   為了確定在結腸炎中用納米粒子靶向MIR31的可行性,我們設計了一種基于蛋白質的封裝微球作為MIR31模擬傳遞系統(圖6A)。在該系統中,α-乳酸白蛋白(a-La)在Glu和Asp位點被部分水解以生成兩親性肽,可以自組裝成具有許多帶負電荷羧基的約20 nm肽體(PSs)22(圖6B和C)。為了通過靜電吸附連接MIR31模擬物,我們使用馬來酰亞胺(Mal)反轉PS表面的Zeta電位(圖6C)。PStMal的大小(直徑)和Zeta電位隨時間穩定(圖6D–F)。然后使用Mal將MIR31模擬物加載到a-La PS上(圖6G)。載有MIR31的模擬PS(PS-MIR31)納米顆粒具有低細胞毒性(圖6H),并且能夠將MIR31傳遞到細胞中(圖6I)。為避免腸道中基于肽的納米顆粒快速降解,我們將它們封裝在微球中,該微球是通過將羧基豐富的TEMPO氧化魔芋葡甘露聚糖(OKGM)與Fe3 +OKGM-PS-MIR31)交聯而形成的(圖6J)。 OKGM-PS-MIR31微球的尺寸范圍為10到50毫米(圖6J)。然后通過灌腸施用OKGM-PS-MIR31微球以檢查其體內治療效果。OKGM-PS-MIR31可以將PS-MIR31釋放到結腸上皮細胞(圖6K),導致MIR31增加。

   OKGM-PS-MIR31微球可以顯著拯救MIR31 /小鼠的DSS結腸炎相關表型。該文獻測試OKGM-PS-MIR31微球對WT小鼠中DSS誘導的結腸炎的預防作用。OKGM-PS-MIR31微球減輕了炎癥,并減輕了結腸上皮的完整性,這通過增加體重,減少免疫反應,延長結腸長度和增加上皮細胞增殖來表明(圖7A–G)。與之前的發現一致,OKNT-PS MIR31處理的小鼠結腸中的WNT和Hippo信號通路發生了改變(圖7G和補充圖16A和B),而MIR31靶基因減少了(圖7H和補充圖16C)。

四川快乐十二投注