單細胞RNA測序揭示了人胚胎植入前后滋養細胞命運分化的調控機制
欄目:最新研究動態 發布時間:2020-04-03
通過功能缺失驗證了TBX 3在滋養層分化中的作用。該研究證明了為研究滋養細胞在著床前發育過程中的發育和分化規律......

   同濟大學醫學院聯合美國洛杉磯加州大學分校和吉安生殖醫學中心,2019年10月發表于國際雜志PLOS Biology的一篇研究“Single-cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism for trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses” (影響因子=8.386),
   本實驗模擬了人類受孕期胚胎從囊胚到后期早期的發育過程,通過使用體外共培養系統進行Lantation階段,并從這些概念中分析476個個體滋養細胞的轉錄體。該研究揭示了調節周圍環境的遺傳網絡,胚胎滋養層發育。在確定滋養層細胞何時發生分化時,確定T-box轉錄因子3 (Tbx 3)是差異的關鍵調節因子,細胞滋養細胞(CT)轉化為合體滋養細胞(ST)。通過功能缺失驗證了TBX 3在滋養層分化中的作用。最后,該研究團隊證明了為研究滋養細胞在著床前發育過程中的發育和分化規律提供了有價值的研究資源。
結果一、植入胚胎發育過程中人滋養層細胞的轉錄組譜
   將體外受精產生的概念培養到胚泡期。在胚泡期(第6.5天),轉移到裝有人原代EM細胞的培養皿中。在第8天,所有共培養的概念動物都從透明帶中孵出,并附著在盤子的底部,并采用扁平結構,與以前的報道非常相似(圖1B和1G)。


   為了獲得植入胚胎發育過程中人滋養層細胞的轉錄組譜,從第6天到第10天收獲了19個概念細胞的單細胞,并補充了25個EM細胞。成功地分析了614個單細胞的轉錄組,主成分分析(PCA)和無偏層次聚類表明概念EM細胞和EM細胞形成2個不同的簇(圖2A),并且一些EM細胞在細胞挑選過程中被錯誤標記為概念細胞(圖2B)。
使用300個譜系標記的PCA分析顯示,EPI和PE細胞與TE譜系細胞分離(圖2C和2D)。此外,EPI和PE細胞與TE相比,其相應的標記基因表達更高(圖2E),而特征良好的TE標記(如GATA2和GATA3)在所有TE譜系細胞中均高表達(圖2F)。這些結果表明該算法忠實地將EPI和PE譜系細胞與TE譜系細胞分離。
  從第6天到第10天,發現5種TE標記,即KRT19,KRT18,KRT8,GATA2和GATA3始終在TE和滋養細胞中高表達(圖2F和2H)。總的來說,單細胞RNA-seq數據提供了從胚泡到植入后早期階段體外培養的人類概念中滋養細胞的全面轉錄組譜分析。


二、加權基因共表達網絡分析表明植入后滋養層細胞發育的遺傳程序動力學
   PCA顯示滋養層細胞按其發育日分組(圖2D)。為了系統地研究遺傳程序的動力學,對2,464個基因進行了加權基因共表達網絡分析(WGCNA),這些基因在不同發育階段的滋養層細胞中可變表達。WGCNA確定了8個基因模塊,每個模塊都包含一組在特定發育階段傾向于共表達的基因(圖3A)。通過將模塊表達與發育日聯系發現這8個模塊共同代表了3個遺傳網絡,這些網絡在第6天,第7-8天和第8-10天特別上調(圖3B)。GO術語(例如細胞遷移,細胞外基質組織和對缺氧的反應)富含這些基因,表明激活了滋養細胞入侵(圖3C)。 為了進一步鑒定可能在這3個遺傳網絡中發揮關鍵調控作用的基因,基于WGCNA量模內基因連通性鑒定了240個中樞基因。結果發現WGCNA集線器基因可能是早期胎盤發育的潛在關鍵調控基因。


三、單細胞RNA測序揭示了滋養細胞分化的時機
   滋養層亞系(例如EVT,CT和ST)衍生自多能滋養層。為了研究多能滋養細胞首次分化為滋養細胞亞系,使用了基于共享最近鄰(SNN)圖的聚類算法對476個滋養層細胞進行了無偏聚類,并將它們分為6個子種群(圖4A和4B)。通過檢查先前定義的亞譜系標記基因的表達,發現EVT標記(ITGA5,HLA-G,FN1,MMP2,CD9和ITGA1)或ST標記(CGB5,PSG1,HSD3B1,CYP19A1,SDC1,INHA,ERVW- 1,ERVV-1和CGA在簇2或5中高度表達,而簇4共表達CT標記(ITGA6,TP63,CTNNB1,LRP5,TEAD4,ELF5,FGFR2和FZD5)和EVT標記基因相似到群集1(圖4C)。通過鑒定了在簇2、4和5中特異性表達的基因。發現許多ST標記基因,例如HSD3B1,CYP19A1,SDC1,ERVW-1(Syncytin-1),ERVV-1,CGA和CGB,在簇5中特異性高表達。CT標志物,例如ITGA6和FZD5,在簇4中特異性表達。一些EVT標志基因,例如MMP2,在簇2中特異性高表達(圖4D)。在第8天ST細胞變得更加豐富(168個細胞中的16個;圖4E)。免疫染色顯示,最早可在第7天檢測到hCGβ陽性細胞,并在第8天變得更為豐富(圖4F)。這些結果表明ST細胞首先在第7天后出現,并在第8天后變得更豐富。該研究發現EVT細胞在第7天的整個概念中都沒有,但在第8天出現,表明EVT在第7天后產生(圖4E)。結果揭示了ST和EVT在體外植入概念中出現的時間過程。


四、ST的開發需要TBX3
   通過使用完善的體外滋養細胞分化系統 驗證TBX3在滋養細胞分化中的功能,該系統通過用單磷酸環腺苷(cAMP)類似物8-Br-處理滋養細胞細胞系JEG-3來模擬CT到ST分化。在未經8-Br-cAMP處理的對照JEG-3細胞中,細胞融合率低于1%,并且幾乎無法檢測到ST標記hCGβ表達,表明在處理之前ST的生成極少(圖5A和5B,0mM組)。與對照組相比,用8-Br cAMP處理48小時后,JEG-3細胞顯示出大大增強的細胞融合和hCGβ,融合率與8-Br-cAMP濃度相關(圖5A和5B)。值得注意的是,TBX3在對照組中未表達,但通過8-Br-cAMP處理顯著上調,并且上調倍數也與8-Br-cAMP濃度相關(圖5A和5C)。
   TBX3敲低還顯著減少了細胞融合(shTBX3-a和shTBX3-b細胞分別減少了75%±7%和64%±14%;圖5D)和下調的ST標記轉錄,包括人絨毛膜促性腺激素亞基(CGA和CGB),Syncytin(ERVW-1)和其他HERV衍生的基因(ERVV-1和ERVV-2;圖5E-5G。免疫染色顯示,通過TBX3敲低,hCGβ蛋白水平降低(圖5H)。綜上所述,TBX3是ST形成所必需的。


五、與EM細胞共培養會影響與滋養層發育相關的基因
   
與EM細胞共培養7天細胞中有241個基因顯著上調,而共7天細胞中有140個基因顯著下調(Wilcox測試,調整后p <0.05)。 GO富集分析表明,在共7天的細胞中上調的基因與mRNA處理和翻譯等術語相關,而下調的基因與包括骨骼肌組織再生和上皮細胞成熟的術語相關。通過檢查DEG,發現與滋養細胞增殖,遷移和侵襲有關的基因——EIF5A。 WEE1,一種調控與滋養層細胞細胞周期進程相關的有絲分裂的基因;這些結果表明與EM細胞共培養可以影響與滋養細胞發育相關的基因的表達。

六、轉錄組學分析揭示了極性TE標記基因在植入后滋養層亞群中的表達模式
   使用129個先前鑒定的極性TE標記進行scRNA-seq數據分層聚類,將第7天的滋養細胞牢固地分為2個亞群,這與第7天存在的極性和壁厚TE一致(圖6A)。然后發現極性TE標記在第6天和第7天非共培養的細胞中均低表達,在不同發育天的CT細胞中均中等表達。有趣的是,在包括EVT和ST在內的分化的滋養細胞中,極性TE標記顯著上調(圖6B)。

結論:
   該研究建立了植入后滋養層細胞的單細胞轉錄組譜,發現TBX3作為人類滋養細胞分化的“必需上游”調節劑,發揮了新的作用。 為后續的研究提供了獨特的資源,用于了解與早期滋養層缺陷相關的早期胎盤發育和發病機理。

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