miR-26a調節前列腺癌細胞胞外囊泡的分泌
欄目:最新研究動態 發布時間:2020-08-07
細胞外囊泡(EV)參與癌癥進展過程中的細胞間通訊,因此,闡明腫瘤細胞中EV分泌的機制將有助于EV靶向腫瘤治療的發展.今天...

    細胞外囊泡(EV)參與癌癥進展過程中的細胞間通訊,因此,闡明腫瘤細胞中EV分泌的機制將有助于EV靶向腫瘤治療的發展。今天小編給大家介紹發表于“SCIENCE ADVANCES”上的文章“miR-26a regulates extracellular vesicle secretion from prostate cancer cells via targeting SHC4, PFDN4, and CHORDC1”,帶大家詳細了解EVs參與前列腺癌進展的機制。

    在這里,我們進行了基于miRNA的高通量篩選,使用外篩試驗來識別EV分泌的調節因子。通過這種方法,我們鑒定了miR-26a參與前列腺癌(PCa)細胞的EV分泌。此外,我們發現SHC4、PFDN4和CHORDC1基因在PCa細胞中調節EV的分泌。在體內研究中,這些基因被抑制。
結 果:

1.PCa中調控EV分泌的miRNA的篩選
    首先,我們將PC3M細胞接種于96孔板中,用miRNA模擬物進行轉染。轉染24小時后,將培養基改為無血清培養基,再孵育48小時。之后,收集CM,評估EV水平(圖1A)。我們對傳統的EV標記物進行免疫印跡,并通過免疫印跡確認來源于PC3M的EV為CD9和CD63陽性(圖1B);因此,我們使用CD9抗體檢測第一次篩查中CD9/CD9雙陽性EV分泌的變化。
    接下來,我們進行了miRNA的篩選。根據圖1C所示的標準選擇miRNAs。我們進行了三次篩選并選擇了58個miRNAs。在排除數量大于2000的miRNAs后,我們選擇了30個miRNAs(圖1C)。接下來,為了進一步驗證最初的篩選,我們評估這30個miRNAs中CD63/CD63陽性EVs和CD9/CD63雙陽性EVs的分泌情況。根據EV分泌/細胞活力相對值低于0.8的標準,我們選擇miR-26a和miR-194作為調節EV分泌的候選miRNA(圖1D)。與正常前列腺組織相比, miR-26a在前列腺癌組織中顯著下調,而miR-194的表達與正常前列腺組織相比沒有差異(圖1E)。這些結果提示miR-26a參與PCa的EV分泌。此外,轉染miR-26a模擬物的PCa細胞分泌的EVs顆粒數顯著減少(圖1F,G)。因此,選擇miR-26a進行下一步分析,并探討miR-26a是否調節PCa中EV的分泌。


2.SHC4、PFDN4和CHORDC1參與miR-26a介導的EV分泌
    為了進一步闡明miR-26a在EV分泌中的分子機制,我們鑒定了miR-26a的靶基因。在miR-26a模擬物或對照物轉染后,對PC3M和PC3進行mRNA微陣列分析。發現PCa細胞中miR26a的過表達下調了88個基因(圖2A)。然后,為了篩選調節EV分泌的基因,利用ExoScreen進行高通量篩選。將PC3M細胞接種于96孔板上,轉染88個候選基因的siRNA。轉染24小時后,將培養基改為無血清培養基,培養48小時。從轉染的PC3M細胞中,收集CM,通過ExoScreen和MTS分析評估EV水平(圖2B)。CD9-和CD63-陽性的EVs通過ExoScreen進行評估。所選基因的標準如圖2C所示。最后,SHC4,PFDN4,CHORDC1和PRKCD被確定為調節EV分泌的候選基因(圖2C)。接著,我們探究這些基因對siRNA處理后PCa細胞分泌EVs的影響。發現轉染SHC4、PFDN4和CHORDC1三個基因的siRNAs后,PCa細胞分泌的EV水平降低,表明這些基因是EV分泌的調節因子(圖2D和E)。qRT-PCR證實了轉染siRNA的PCa細胞中這三個基因的下調(圖2F)。這些結果提示SHC4、PFDN4和CHORDC1參與了PCa中EV分泌的上調。


3.miR-26a通過靶向SHC4、PFDN4和CHORDC1抑制PCa癌細胞EV分泌
    通過qRT-PCR和免疫印跡分析,發現miR-26a抑制PCa細胞中SHC4、PFDN4和CHORDC1的表達水平(圖3A)。然后,為了確定miR-26a是否直接調控這些基因,進行了熒光素酶報告分析(圖3B)。發現miR-26a的異位表達顯著抑制野生型SHC4、PFDN4和CHORDC1 3’UTRs的熒光素酶活性(圖3C)。此外,我們還研究了這些基因在PCa組織中的表達水平。發現PCa組織中PFDN4和CHORDC1的表達水平明顯高于正常組織(圖3D)。


4.PFDN4、SHC4和CHORDC1在體內調節EV分泌和促進腫瘤發生
    miR-26a抑制PCa的腫瘤形成,其抗腫瘤活性可能與miR-26a抑制PCa細胞分泌EV有關。為了證實miR-26a靶向基因在PCa衍生EVs中的作用,我們進行了體內實驗。研究發現,這些基因的缺失抑制了EV的分泌(圖4A)。我們評估了SHC4、PFDN4和CHORDC1下調在該模型中的作用,發現缺失這些基因的異種移植的小鼠腫瘤較小,重量小于對照小鼠(圖4B,C)。此外,注射PC3M來源的EVs的裸鼠腫瘤組織顯示部分挽救的腫瘤大小和重量(圖4D)。上述數據表明,miR26a與其靶基因SHC4、PFDN4和CHORDC1之間存在一個信號網絡,并證明了miR-26a在PCa中調節EV分泌的新機制(圖5)。


結 論:
    本研究廣泛篩選了PCa中調節EV分泌的miRNA,發現miR-26a通過靶向SHC4、PFDN4和CHORDC1調節EV分泌。這一發現揭示了miRNA通過抑制EV生物發生抑制腫瘤的新思路,為PCa的治療提供了新的途徑。



 


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